雙擎驅動 洞見多維 | 基于CytoFLEX mosaic的40色全光譜免疫表型分析方案
貝克曼庫爾特生命科學研究團隊成功將40色全光譜流式細胞術應用于人外周血免疫細胞的深度表型分析，進一步拓展了高維流式在免疫研究中的應用邊界。該方案基于經典OMIP-69[1,2]面板進行優化，結合CytoFLEX LX流式細胞分析儀和CytoFLEX mosaic 88光譜檢測模塊，實現了對CD4?/CD8? T細胞、調節性T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞等關鍵免疫群體的精準識別與功能分析。
實驗采用專有的混合泊松算法，有效降低光譜重疊干擾，確保信號解析的精準度，實現了穩健的光譜解析，為復雜免疫圖譜的構建提供了可靠工具。本研究證明了CytoFLEX mosaic在適配已發表panel方面的可靠性和靈活性，有助于快速、標準化地實施復雜的免疫表型分析，減少設置時間并最大限度地減少操作不一致性。
熒光染料選擇與方案設計
本方案中選擇的大多數熒光染料基于先前發表的OMIP-69中所使用的染料，進行的替換主要是由于抗體的可獲得性。值得注意的是，我們加入了RealBlue?（熒光染料，這些染料在原始方案設計時不可用，用以替代性能稍差的熒光團。這些替換經過仔細選擇，以在最小化對整體性能影響的前提下，保持方案的完整性（圖1）。使用相似性指數（圖2）對具有獨特發射光譜的熒光染料進行了量化。相似性指數≤ 0.98的熒光染料對被認為足夠獨特，可以共同使用。
為確保熒光染料之間的兼容性，我們使用了復雜度指數，該指數測量了熒光染料之間的累積光譜干擾，同時考慮了溢出和自發熒光效應。較低的復雜度指數表明光譜重疊減少，解析數據的分辨率提高。最終方案的復雜度指數低至40.3。
熒光染料對中具有相似光譜的，如BB515/FITC、BV421/SuperBright436和Alexa Fluor 647/SparkNIR 685，被包含在方案中，并通過選擇合適的標志物、調整抗體用量以及使用泊松混合解析算法來謹慎管理，以減少信號重疊。
選擇ViaKrome 808進行活性評估是因為其獨特的近紅外光譜特征，這最大限度地減少了與其他熒光染料的干擾，使其與多色流式細胞術方案廣泛兼容。
圖1：40種熒光染料的光譜特征。所有光譜均已歸一化至峰值通道以便直接比較，并使用CytExpert for Spectral軟件進行可視化
圖2：相似性指數。解析矩陣在設門于細胞的樣本上制備，并用于解析40色多色樣本。本方案中使用的選定熒光染料的相似性指數，其復雜度得分為40.3，使用CytExpert for Spectral軟件生成
設門策略與數據分析
圖3解釋了如何使用手動設門來識別主要細胞群體。所有預期的細胞群和表型均被準確檢測到。
圖4顯示了通過優化活/死染色前的洗滌條件改善CXCR3和CXCR5染色。
為了分析復雜的免疫譜數據，我們采用了Cytobank分析平臺上降維和聚類算法的分析流程。fcs文件使用混合泊松解析算法進行預處理，然后上傳到Cytobank平臺云端進行分析。
圖5：使用t-SNE-CUDA降維進行基于機器學習的血細胞分析。A) 每個圖譜按單個標志物通道著色，顏色強度標尺（顯示在每個圖的右側）代表相應標志物的相對表達水平。 B) 密度圖提供了六名供體中觀察到的獨特模式的可視化表示。
圖6：FlowSOM聚類與手動設門群體的對比
結論
本研究成功對40色OMIP-69方案進行了精簡與優化，使其適用于高通量免疫表型分析，能夠全面解析主要免疫細胞亞群。數據采集在配備CytoFLEX mosaic 88光譜檢測模塊的CytoFLEX LX流式細胞儀上完成，該平臺以其高分辨率和靈活性，實現了全光譜檢測性能。通過混合泊松算法進行光譜解析，有效降低了發射光譜重疊帶來的干擾，確保了信號的精準分離。實驗結果表明，解析出的細胞群體與參考文獻1高度一致，并通過設門策略成功驗證了解析效果與表型識別的準確性。
為深入挖掘此高維數據集的價值，我們進一步應用了t-SNE（CUDA加速的）降維與FlowSOM無監督聚類功能。在Cytobank平臺上，這些算法即便使用默認設置，也能實現與手動設門相媲美的免疫群體自動識別，提供了一種更客觀、可擴展的分析方案。
綜上所述，CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀結合本分析流程，充分展現了其在高效實施復雜多色方案方面的強大能力，僅需最小化優化即可獲得可靠數據。
參考文獻
[1] Park LM, Lannigan J, Jaimes MC. OMIP-069: Forty-color full spectru flow cytometry panel for deep immunophenotyping of major cell subsets in human peripheral blood. Cytometry A 2020;97:1044-51.
[2] Park LM, Lannigan J, Low Q, et al. OMIP-069 version 2: Update to the 40-color full spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of major cell subsets in human peripheral blood. Cytometry A 2024;105:791-9.
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