如何更好的理解光譜流式中的擴散誤差（Spreading Error）
上篇：原理篇
光譜流式細胞儀可捕獲熒光染料的完整發射光譜，從而實現對弱表達marker的檢測和重疊熒光信號的分離。然而，當來自不同熒光染料的信號未被準確分離時，光譜流式結果可能會受到解混誤差（Unmixing error）和溢出擴散誤差（Spillover spreading error）的影響，進而導致數據質量不佳，這些問題在復雜的多色Panel中尤為常見。CytoFLEX mosaic光譜檢測模塊利用高分辨率光譜數據和單染樣本對照，通過先進的光譜解析算法，為準確的識別和解析不同熒光染料，提供了更好的解決方案。
Unmixing Error
在光譜流式細胞儀中，當我們在使用更多顏色的Panel時，遇到的一大挑戰就是Unmixing Error（如圖1）。這個問題源于熒光染料的光譜在參考對照與實驗樣品中的不準確匹配。因為光譜流式細胞儀依靠算法來解析具有重疊發射光譜的熒光染料，因此即使很小的光譜不匹配也會導致數據的顯著誤差。
圖1：Unmixing Error示例，如箭頭指示，在細胞群中表現為傾斜的模式
Unmixing Error嚴重的后果之一是Spreading Error的增加，即來自明亮熒光染料的信號被錯誤地分配到其他檢測通道。這種錯誤分配會導致背景噪聲升高，降低弱表達或稀有細胞群的分辨能力，引起實驗結果的靈敏度和分辨率總體下降。
Unmixing Error會扭曲熒光強度分布，導致信號分配不準確；設門不正確，以及樣品或實驗之間的可變性增加，比如樣本制備的重復性等，這些因素共同降低了實驗數據的可靠性和重復性。
值得注意的是，雖然光譜不匹配是Unmixing Error的主要驅動因素，但其他因素包括不合適的單染對照，串聯染料的不穩定性，自發熒光的產生，儀器穩定性和不合適的光譜矩陣計算同樣也會有影響（如圖2所示）。因此更好的應對Unmixing Error需要謹慎注意Panel設計，熒光染料的選擇，以及使用能更好匹配實驗樣本的高質量單染對照。
圖2：Overview of Unmixing Error in Flow Cytometry. This schematic diagram illustrates the concept of Unmixing Error through three interconnected sections: Causes, Consequences, and Mitigation
Spillover Spreading Error
溢出擴散誤差（Spillover Spreading Error) ，源于熒光檢測的物理和統計性質。當一種熒光基團的信號在其他檢測器中引入了可變性或增加了測量噪聲，由于共享光譜區域，會導致信號分布更加發散，使分辨弱表達或稀有細胞群體的能力下降，尤其是當標志物為共表達時。（如圖3示例）
圖3：Spillover Spreading Error示例。此處的擴散誤差被視為一種“魚尾狀模式"，其中PE-CY5信號溢出到Alexa Fluor647中中，導致CD3+CD56-的信號失真并使細胞群顯得比實際更寬，進一步加劇了信號重疊，降低了CD3+CD56+ NKT細胞群的分辨率
Spillover Spreading Error的產生包含多種因素：
光子檢測的泊松分布性質：其中較亮的信號固有地產生更多統計誤差
檢測系統的電子噪音
光譜重疊，特別是與明亮的熒光團或高表達的標志物共享探測器
因此即使的光譜解析，Spillover Spreading Error也無法消除，在高維多色實驗和共表達標記的分析中影響尤為明顯。
如何減輕Spillover Spreading Error的影響：
合理的Panel設計非常關鍵：共表達markers間的熒光素選擇應盡量減少擴散誤差
使用適當的對照，如熒光減一對照（FMO），有助于確定熒光擴散誤差對設門精度的影響
下表總結了影響光譜流式細胞術中Spillover Spreading Error的綜合因素。
下篇：應用篇
除了熒光染料，樣本因素，儀器因素，對照設置的因素以外，光譜拆分算法對于Spillover Spreading Error的降低也發揮了重要的作用。CytoFLEX mosaic光譜模塊為用戶提供了兩種分解算法：經典的LSM和貝克曼庫爾特生命科學專有的混合泊松算法。
LSM算法是簡單和被廣泛使用的方法。它假設噪聲出現在所有通道的水平是均一的，無論信號強度如何，所有檢測器都具有相同的信號強度方差。然而在實際情況下，這種假設通常不成立。比如檢測器在不同波段的噪音，以及抗體帶來的噪音等，因此導致解析的誤差，進而加劇數據的溢出擴散誤差（Spillover Spreading Error）。
混合泊松算法是基于光子發射的隨機性（泊松統計），對噪音信號進行建模，提供了更真實的信號變異性反饋。
針對同一組樣本，這兩種算法的表現如何，我們通過一個案例研究來展示。
案例研究：10色方案設計挑戰
以下的10色實驗采用新鮮人外周血樣本，通過染色和裂紅處理，并在CytoFLEX LX mosaic光譜流式細胞儀上進行了檢測，采用兩種光譜分解算法最小二乘法（LSM）和混合泊松算法（Poisson Hybrid）分別分析結果。
結果
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圖4：混合泊松算法與LSM算法在減少擴散誤差方面的比較。使用一個10色Panel檢測人外周血中的主要細胞亞群，并使用混合泊松算法和LSM算法進行解混。(A) 使用LSM（最小二乘法）算法解混的設門數據。(B) 使用混合泊松算法解混的設門數據。(C) 為所選門計算的相對標準偏差 (rSD) 表明混合泊松算法減少了擴散，突顯了僅靠溢出擴散矩陣 (SSM) 評估分數未能捕捉到的分辨率改善。(D) 比較兩種算法的SSM表顯示各檢測器的擴散分數差異
圖4A為LSM和圖4B為混合泊松算法，細胞群P1，P2，P3和P4表現出兩種解析算法之間信號擴散的明顯差異。圖4C定量地說明了不同算法下通道間信號擴散誤差的差異。在光譜解析中，陰性信號的rSD很重要，因為它反映了信號分離的一致性和準確性，較低的rSD值表明細胞群更緊密，這對于高維流式細胞術中細胞群的準確識別和定量至關重要。圖4D所示的溢出擴散矩陣 (SSM) 用于測量一個熒光染料的信號干擾到其他檢測通道的程度，較低的SSM值意味著熒光染料之間的干擾較小，從而產生更干凈的數據、更好的細胞群分離和更可靠的分析結果。以上結果均顯示，混合泊松算法提高了光譜解析的效率和準確性。
需要注意的是，無論使用的抗體是否經過滴定，此處顯示的結果在使用具有更多熒光染料、高度重疊染料或不同類型樣品的不同panel時可能會有所不同。建議用戶切換解混算法以確定哪種算法適合其特定要求和實驗條件。也就是說，我們的研究表明，混合泊松算法有助于減少擴散誤差，特別是在使用高度重疊染料組合的panel以及并非所有抗體都滴定的panel中。
溢出擴散誤差（Spillover spreading error）和解混誤差（Unmixing error）是光譜流式細胞術中的主要挑戰，尤其是在高維Panel中，這些誤差源于生物和技術的原因，包括熒光染料亮度、光譜重疊、儀器配置和對照質量等。可以通過優化的Panel設計和對照選擇，使擴散誤差最小化，這也是確保可靠的數據解讀至關重要的一步。貝克曼庫爾特生命科學專有的混合泊松算法，使用LSM結果作為初始參數估計，然后結合了信號和噪聲的泊松特性，可進一步降低數據的溢出擴散誤差。
參考文獻（上下滑動閱覽）
