速率區(qū)帶離心法 |你的分離純化方法選對了嗎？

點(diǎn)擊次數(shù)：3427 更新時(shí)間：2020-10-27

密度梯度離心（isodensity centrifugation method）又稱為區(qū)帶離心。

該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)使樣品中幾種或全部組分分離，具有良好的分辨率，分離效果好，可一次獲得較純組分。

缺點(diǎn)是離心時(shí)間較長，需制備梯度液，操作要求高。

按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為速率區(qū)帶離心法（rate zonal centrifugation method，R-Z）和等密度離心法 (isopycnic centrifugation method)。

速率區(qū)帶離心也可稱為等區(qū)密度離心，是根據(jù)樣品中不同組分粒子所具有的不同的體積大小和不同的沉降系數(shù)將混合樣品進(jìn)行離心分離提純。

離心時(shí)將需要分離的樣品溶液置于由密度梯度材料（如蔗糖、氯化銫 (CsCI)、溴化鈉等）形成的梯度液柱上面，樣品粒子的密度必須大于梯度液柱中任一點(diǎn)的密度，否則無法得到理想的區(qū)帶離心效果。離心時(shí)，混合樣品中不同的組分將在梯度液柱的不同位置分別形成各自的區(qū)帶，選擇適合的轉(zhuǎn)速和時(shí)間進(jìn)行離心，當(dāng)各組分區(qū)帶距離拉得遠(yuǎn)時(shí)，結(jié)束離心，然后將區(qū)帶取出。這樣只需通過一次離心就可以把混合樣品中的各組分分離提純，其純度和回收率均可滿足要求。

優(yōu)點(diǎn)是一次分離純化，組分的沉降系數(shù)相差 20% 以上的即可選用此法，分辨力高，操作熟練可以將組分沉降系數(shù)相差 5%～10% 的樣品很好的分離。

缺點(diǎn)是材料的條件限制，樣品液濃度不能太高，否則操作條件很難控制，同時(shí)此法與差速離心法相比，處理樣品的量要小的多。

圖 1 速率區(qū)帶離心

速率區(qū)帶離心的時(shí)間必須嚴(yán)格控制，不能太短，否則樣品區(qū)帶不清，時(shí)間也不能太長，否則待分離組分可能沉底。需要分離的樣品顆粒的沉降速度取決于顆粒形狀、大小、密度及離心力等因素。離心前后樣品的狀態(tài)如圖 1 所示。

速率區(qū)帶離心經(jīng)典的應(yīng)用就是通過蔗糖密度梯度離心，進(jìn)行各種亞細(xì)胞器（核糖體、線粒體、Exosome 等）和病毒顆粒（病毒載體、疫苗等）的純化。例如，我們在上一期中得到的 70S 核糖體沉淀，經(jīng)過水解后，可利用蔗糖密度梯度離心，進(jìn)一步分離純化得到 50S 和 30S 的兩個(gè)亞基。具體的實(shí)驗(yàn)流程如下：